1.細胞毒性測試

MTT 法（四唑鹽比色法）

將細胞接種于 96 孔板中，培養至合適密度（例如，對數生長期細胞）。設置不同 CY2 - 牛血清白蛋白（CY2 - BSA）濃度梯度的實驗組，同時設置空白對照組（只含細胞和培養基）和陰性對照組（含未標記的 BSA 和細胞、培養基）。

將 CY2 - BSA 加入實驗組孔中，繼續培養一段時間（如 24 - 48 小時）。然后向每孔加入 MTT 溶液，繼續孵育 3 - 4 小時，使 MTT 被活細胞中的線粒體琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍紫色甲臜結晶。棄去上清液，每孔加入 DMSO 溶解甲臜結晶，用酶標儀在 490nm 波長處測量吸光度。

根據吸光度計算細胞存活率（細胞存活率 =(實驗組吸光度 - 空白組吸光度)/(陰性對照組吸光度 - 空白組吸光度)×100%）。選擇細胞存活率在一定范圍內（如 80% 以上）的 CY2 - BSA 濃度，初步確定為安全濃度范圍。

Live/Dead 細胞染色法

同樣將細胞接種并設置 CY2 - BSA 濃度梯度實驗組、空白對照組和陰性對照組。將 CY2 - BSA 加入實驗組培養后，用 Live/Dead 細胞染色試劑盒對細胞進行染色。

活細胞被染成綠色，死細胞被染成紅色。通過熒光顯微鏡觀察細胞染色情況，統計活細胞和死細胞的比例。確定使細胞死亡率較低的 CY2 - BSA 濃度范圍。

2.熒光強度測試

體外實驗

準備一系列不同濃度的 CY2 - BSA 溶液，在固定激發波長（CY2 的激發波長一般在 488 - 495nm 左右）下，使用熒光光譜儀測量其熒光發射強度（CY2 的熒光發射波長在 500 - 520nm 左右）。

繪制熒光強度 - 濃度曲線，隨著 CY2 - BSA 濃度增加，熒光強度通常會增加，但當濃度過高時，可能會出現熒光自猝滅現象，即熒光強度不再隨濃度增加而線性增加，甚至下降。選擇熒光強度增加且未出現明顯自猝滅的濃度范圍，這個范圍通常是比較合適的標記濃度范圍。

體內實驗（以小動物成像為例）

將不同濃度的 CY2 - BSA 通過合適的途徑（如靜脈注射、腹腔注射等）注入實驗動物體內。在注射后的不同時間點，使用體內成像系統在 CY2 的熒光發射波長范圍內進行成像。

觀察不同濃度下熒光信號在體內的分布和強度變化。選擇既能產生足夠強的可檢測熒光信號，又不會因濃度過高導致非特異性結合和背景信號過強的 CY2 - BSA 濃度。

3.標記效率測試

光譜法結合蛋白定量法

采用不同濃度的 CY2 - BSA 進行標記反應，反應完成后，通過紫外 - 可見分光光度計測量 CY2 的吸收峰（在 488 - 495nm 左右）強度來估算 CY2 的含量，同時使用蛋白定量方法（如考馬斯亮藍法、BCA 法等）確定 BSA 的含量。

根據 CY2 和 BSA 的含量計算標記效率（標記效率 =（實際標記的 CY2 摩爾數 / 理論上可標記的 CY2 摩爾數）×100%）。選擇標記效率較高的 CY2 - BSA 濃度作為最佳標記濃度。

4.電泳結合熒光成像法

對不同濃度 CY2 - BSA 標記后的產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS - PAGE）。由于 CY2 帶有熒光，通過熒光成像系統觀察電泳后的凝膠，比較不同濃度標記產物的條帶熒光強度和位置。

標記效率高的 CY2 - BSA 濃度對應的條帶熒光強度相對較高且條帶位置符合預期（CY2 標記后 BSA 分子量增加），綜合判斷選擇最佳標記濃度。

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